褐煤粉塵對礦區復墾土壤有機碳礦化及細菌群落的影響

王浩1,2，王偉1,2，薄慧娟1,2，張旭龍3，李澤瑾1,2，王海波1,2，張強1,2*，靳東升1,2* 1.山西農業大學資源環境學院 2.土壤環境與養分資源山西省重點實驗室 3.中國農業大學資源與環境學院

摘要:煤粉塵沉降至地表后能夠顯著提高土壤有機碳含量，改變土壤理化性質和土壤微生物群落結構。通過添加褐煤粉塵的土壤培養試驗，探究煤粉塵輸入的有機碳對土壤有機碳礦化效果及細菌群落的影響。結果表明：在褐煤粉塵影響下，土壤CO2礦化量和礦化速率較對照組最大提升55.02%和54.58%（第5天）；土壤易氧化有機碳和土壤微生物生物量碳含量在培養結束后較最大值分別降低40.75和141.39 mg/kg。添加褐煤粉塵導致變形菌門的相對豐度顯著降低，而酸桿菌、放線桿菌和厚壁菌門的相對豐度升高。褐煤粉塵輸入的有機組分能夠在短期內產生激發效應，其自身被土壤細菌分解的過程也能促進土壤CO2的礦化累積，并且提高土壤細菌群落的多樣性和變異程度。褐煤粉塵中的有機碳極大程度參與了土壤有機碳庫周轉過程。關鍵詞:褐煤粉塵 / 礦化過程 / 活性有機碳 / 官能團結構 / 土壤細菌群落 

煤粉塵是細小的煤炭顆粒，物質組成包括有機組分和無機組分，其所含有機組分隨煤化程度的不同可以占到煤炭質量的20%~85%[1-3]。煤粉塵經擾動形成揚塵后再沉降至地表，能夠顯著提高該區域土壤總有機碳含量[4-5]，并且這部分有機碳能夠在土壤中持續保留數十年[6-7]。國內外學者將土壤中來源于煤的這部分有機碳稱為黑炭（black carbon，BC）[8-9]或地質成因有機碳（geogenic organic carbon，GOC）[10]。除提高土壤有機碳含量外，煤粉塵對土壤的其他理化性質也存在一定影響。聶小軍等[11]發現煤粉塵在土壤內部的積累可以改善表層土壤的團粒結構性狀。這是由于煤粉塵在團粒結構的形成中充當了有機膠結物質，這部分煤顆粒細小且伴生著伊利石等硅酸鹽黏土礦物，因此使土壤團粒表現出比表面積大、親水性強、表面負電性強等膠體特性[12]。煤粉塵顆粒具有疏松多孔的特點，能夠提高土壤孔隙度并降低土壤容重，改善土壤空氣流通和水分保持能力[13-14]。Spencer等[15]研究表明煤粉塵沉降的土壤表層全氮含量與煤粉塵量呈正相關關系，而劉平等[16]研究顯示土壤表層全氮含量與降塵量和煤粉塵量之間并沒有明顯的相關性，二者結論上的差異可能與煤粉塵中氮含量及煤炭發育程度有關。

煤粉塵進入土壤后也會對土壤微生物產生諸多影響。Cohen等[17]制作了含有褐煤粉塵的固體培養基，在相同試驗條件下培養多孔菌（Polyporus versicolor）和臥孔菌（Poria monticola），結果表明這2種真菌在生長過程中可以將固體褐煤粉塵降解為液體狀態，并據此提出煤粉塵作為微生物生長基質的可能性。劉平等[16]通過分析煤粉塵沉降區域土壤，發現土壤中真菌和放線菌的數量隨著煤粉塵量的增加而增加，細菌數量則無顯著變化。Mukasa-Mugerwa等[18]提出土壤微生物對無煙煤的分解過程同時依靠了植物和根際真菌，二者合力將無煙煤中的有機組分轉化成了腐殖酸的形式。也有研究表明煤粉塵對土壤微生物還存在著一些負面效應，如煤粉塵中廣泛存在的重金屬元素和多環芳烴對土壤部分微生物有顯著的毒害作用[19]，這些重金屬元素破壞微生物的細胞膜結構，甚至導致一些敏感種群的消失[20-21]。上述研究結論的差異也可能與煤粉塵及相應土壤的性質有較大關系。本研究基于課題團隊對煤粉塵沉降的研究基礎[7,16,22-23]，將中國北方煤礦復墾區的褐煤粉塵及土壤作為供試材料，開展土壤添加褐煤粉塵的培養試驗，分析褐煤粉塵添加后土壤有機碳礦化率和活性有機碳組分的變化，探討土壤細菌群落對褐煤粉塵的響應關系，以期為礦區煤粉塵利用及土壤保護與質量提升提供理論支撐。

1. 材料與方法                           

1.1材料與前處理

供試土壤取自山西省古交市屯蘭礦區的煤礦復墾區長期定位平臺，該區域年均降水量為460 mm，年均氣溫為9.5 ℃，土壤類型為黃綿土，土壤基本理化性質見表1。供試土壤在培養試驗前經自然風干后過2 mm篩，并去除其中的根莖與石子等雜物。

褐煤材料取自內蒙古錫林郭勒勝利煤田，工業分析與元素分析如表2所示。為模擬自然狀態的煤粉塵細顆粒，試驗開始前將供試煤炭自然風干，打碎過2 mm篩后，使用行星式球磨機粉碎并過0.053 mm篩。

1.2土壤培養試驗

土壤培養試驗在25 ℃恒溫條件下進行，分3個處理。褐煤粉塵添加量從低到高依次為5.62、14.26和22.89 g，HMA代表添加5.62 g褐煤粉塵的處理，HMB代表添加14.26 g褐煤粉塵的處理，HMC代表添加22.89 g褐煤粉塵的處理，設置3次重復。將不添加褐煤作為對照處理（CK）。土壤培養裝置如圖1所示，將混合均勻的供試土壤（200 g）和褐煤粉塵裝入250 mL培養瓶，保持水分為田持的60%，平衡1周，每個培養瓶旁放置1 mol/L的NaOH溶液100 mL，用于收集培養期間的土壤CO2累積礦化量。

試驗于2023年1月8日啟動，在開始培養第5、15、30、50、75、120天進行破壞性取樣，為減少檢測CO2礦化量時可能出現的誤差，破壞裝置的同時立即測定土壤CO2累積礦化量。取樣后將一部分土壤樣品自然風干，另一部分土壤鮮樣放在−80 ℃冰箱保存備用。為了避免不同時期取土而對土培產生人為的擾動，每個處理在6個取樣時期均有各自專屬的培養裝置，將培養瓶從裝置中取出后收集土壤樣品，所剩的土壤不再繼續參與培養過程。裝置數量共計72個（3梯度×6時期×3重復+18個CK）。

1.3測定指標與方法

土壤CO₂礦化量的測定采用堿液吸收法。培養期間土壤釋放的CO₂被裝置中的1 mol/L NaOH溶液吸收后用堿液稀釋至250 mL定容，取30 mL液體并加入10 mL的1 mol/L BaCl₂和2滴酚酞指示劑，再用0.5 mol/L的HCl溶液滴定并計算土壤CO₂礦化量。

土壤易氧化有機碳（readily oxidation carbon，ROC）的測定使用高錳酸鉀氧化法。取含有15~30 mg碳的土壤樣品（<0.25 mm），加入333 mmol/L的KMnO₄溶液25 mL，依次振蕩、離心和稀釋后在紫外分光光度計上于565 mm波長下比色。根據KMnO₄的消耗量可計算出土壤ROC含量。

土壤微生物生物量碳（microbial biomass carbon，MBC）的測定采用氯仿熏蒸法。取20 g新鮮土壤樣品經氯仿熏蒸24 h后，加入80 mL 0.5 mol/L K2SO4浸提，再加入16.666 mmol/L K2Cr2O7溶液和濃硫酸，消煮后用0.05 mol/L的FeSO4溶液滴定，根據K2Cr2O7消耗量減去未熏蒸土壤的 K2Cr2O7消耗量計算土壤MBC含量。MBC的轉換系數（Kec）為0.38。土壤有機碳官能團的紅外光譜采用傅里葉紅外光譜儀（Thermos Scientific Nicolet，美國）溴化鉀壓片法測定。稱取土壤樣品2 mg和純KBr 200 mg，放入瑪瑙研缽中充分研磨均勻，置于模具中壓成透明薄片后放入紅外光譜儀中測試，波長范圍為400~4 000 cm−1，掃描次數為32次，分辨率為4 cm−1，空氣作為背景，掃描時自動扣除背景光譜。土壤細菌群落測定使用16S rDNA高通量測序技術。使用Qubit 4.0 DNA試劑盒從土壤中收集DNA樣本并保存在−80 ℃冰箱。土壤細菌在V3~V4區域使用引物（341F：5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'和805R：5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）進行PCR擴增，擴增產物經純化和定量后形成測序文庫。測序采用Illumina Miseq PE300測序平臺（Illumina，Inc.，CA，美國），由生工生物工程（上海）公司完成。

1.4 數據處理與分析

使用SPSS 27.0軟件進行方差分析；運用Origin 2021軟件繪制圖表；使用Canoco 5.0軟件進行RDA冗余分析；使用在線分子生態網絡分析通道對土壤細菌進行可視化操作，結合基因文庫GTDB繪制細菌相對豐度圖像。

2.結果與分析

2.1褐煤粉塵添加的復墾土壤有機碳礦化特征 

整個培養周期內各處理土壤CO2礦化量與礦化速率如圖2所示。土壤CO2礦化量在培養0~15 d內迅速升高，而后呈緩慢上升的趨勢，培養120 d后土壤CO2礦化量為362.3~401.8 mg/kg。培養第120天時，HMA、HMB、HMC處理在培養末期的CO2礦化量分別比CK處理提高了4.41%、4.82%和7.47%，從高到低排序為HMC>HMB>HMA>CK。添加褐煤粉塵的3個處理的CO2礦化量在培養周期內與CK處理相比差異顯著（P<0.05）；而3種煤粉塵處理之間只有培養初始時具有顯著的差異，隨著培養時間的延長，HMA、HMB與HMC之間差異逐漸減弱。所有處理土壤CO2礦化速率均表現為先升高后逐漸降低的趨勢，培養第15天時土壤CO2礦化速率達到峰值，HMA、HMB、HMC和CK 4個處理分別達到24.97、25.03、25.51和21.37 mg/（kg·d）。培養周期內，3個褐煤粉塵處理與CK處理的土壤CO2礦化速率均存在顯著差異，而煤粉塵處理之間只在培養第5天時互相表現出顯著的差異。

2.2褐煤粉塵添加的復墾土壤活性有機碳含量變化 

培養周期內土壤ROC含量變化如圖3（a）所示。添加褐煤粉塵能夠直接提高土壤ROC含量，添加量越高ROC含量也越大，且隨著培養時間的延長而逐漸降低。經過120 d培養后，HMA、HMB、HMC和CK處理的土壤ROC含量分別比培養第5天減少了14.06、22.27、35.08和6.57 mg/kg，較培養初始時分別降低85.3%、78.9%、77.6%和84.8%。在整個培養過程中，3個煤粉塵處理之間以及與CK處理間始終存在著顯著差異。培養周期內土壤MBC含量變化如圖3（b）所示。整個培養過程中土壤MBC含量隨培養時間延長呈現先升高后降低的趨勢。在培養初期（0~15 d），褐煤粉塵能夠在短期內使土壤MBC含量迅速提高，并且與CK處理之間形成顯著差異。而在培養中期（30~50 d），3個煤粉塵處理的MBC含量均出現明顯下降，直到第80天時下降至與CK處理水平基本一致，之后各處理間的差異也不再顯著。

2.3褐煤粉塵添加的復墾土壤有機碳官能團結構組成變化 

3個梯度的褐煤粉塵處理具有相似的紅外圖譜（圖4），但主要吸收峰的強度又存在著明顯的差異，這表明褐煤粉塵改變了土壤有機碳官能團的種類和數量。3種煤粉塵處理在3 695和3 622 cm−1處的振動分別表示醇羥基和酚羥基的存在，前者富含沒有形成氫鍵的自由羥基，后者比前者具有更穩定的氫鍵結構[24]。3 415 cm−1處的振動說明了氨基的存在，褐煤粉塵的氨基大部分來源于煤炭形成過程中，古植物體內的蛋白質殘留物在經過部分熱解和碳化后保留穩定的有機氮化合物。位于1 637和1 618 cm−1的雙峰則是芳香族化合物典型的紅外光譜特征[25]，標志著芳香族中C=C鍵的振動。在1 031 cm−1處發生的振動也來自于羥基，結合上述苯環的存在，褐煤粉塵帶來的醇類化合物更有可能是化學性質穩定的苯酚。912 cm−1處主要是非氫和含氫單鍵的振動，包括C—O、C—N和C—H，534 cm−1處的吸收峰也表明了苯環的振動[26]。從圖4可以看出，褐煤粉塵輸入的有機碳中大部分是性質穩定的芳香族化合物，連接在苯環周圍的官能團則以單鍵居多，長鏈的脂肪族化合物數量有限[24]。

2.4褐煤粉塵添加的復墾土壤細菌群落結構變化 

2.4.1 土壤細菌群落α多樣性指數 通過對培養120 d后的土壤進行高通量測序，得到不同處理細菌群落的α多樣性指數，結果如表3所示。與CK處理相比，褐煤粉塵進入土壤后均顯著提高了土壤細菌群落分布的豐度和多樣性；在3組褐煤粉塵處理中，HMB的細菌群落豐度提升最大，HMC的細菌群落多樣性變異最大。褐煤粉塵添加量的提升，一定程度上能對土壤細菌群落產生正向的效果。

2.4.2土壤細菌群落結構組成分析 通過使用統計學分析大于1%門水平的細菌，觀測各處理細菌的群落結構組成（圖5）。細菌在門水平上主要包括變形菌（Proteobacteria）、酸桿菌（Acidobacteriota）、放線桿菌（Actinobacteriota）、擬桿菌（Bacteroidota）、金針菌（Gemmatimonadota）、浮游菌（Planctomycetota）、綠霉菌（Chloroflexi）、疣狀菌（Verrucomicrobiota）、泉古菌（Cernarchaeota）等菌門，上述幾種菌門占土壤中細菌總數的80%以上。

變形菌門是所有處理中最優勢的細菌，在CK、HMA、HMB和HMC處理中相對豐度分別為52.6%、38.5%、41.8%和38.2%。HMA和HMB處理排在第2位的是酸桿菌門，占比分別為14.5%和10.1%；HMC處理中排第2位的是放線桿菌門，占比為11.5%；CK處理中排第2位的是擬桿菌門，占比為13.1%。這一數據表明，褐煤粉塵進入土壤后降低了占主導優勢的變形菌門，提高了放線桿菌和酸桿菌等細菌群落的相對豐度。

2.5土壤細菌群落與有機碳組分相關性分析

土壤中ROC和MBC 2種形態的活性有機碳、土壤有機碳（SOC）及其礦化量與土壤細菌群落的冗余分析如圖6所示。土壤中有機碳組分與土壤CO₂礦化量呈現正相關關系。在對土壤有機碳礦化過程的影響中，土壤MBC較土壤ROC具有更強的影響能力。從土壤細菌群落結構（門水平）與環境因子的相關性來看，排名前10的優勢菌門中，放線菌、酸桿菌、金針菌、綠霉菌、泉古菌、厚壁菌與土壤MBC、ROC和SOC含量之間呈現正相關關系；而變形菌、擬桿菌、疣狀菌和浮游菌則與土壤有機碳組分呈現負相關關系。

3.討論

3.1添加褐煤粉塵對土壤有機碳礦化過程的促進效果 

培養周期內的褐煤粉塵處理在土壤CO2礦化量和礦化速率的方面表現出了與CK處理相同的趨勢，但其處理間的差異與褐煤粉塵添加量有關。褐煤粉塵添加量越高，土壤CO2礦化量和礦化速率也越高，這一現象與外源有機物料輸入的有機碳能夠促進土壤有機碳的CO2礦化過程相似[27-28]，即褐煤粉塵對土壤有機碳產生正向的激發效應，其進入土壤后顯著提高土壤SOC分解礦化的能力，并且添加量越高對這一效果的促進也越強。除上述對土壤有機碳的激發效應外，煤粉塵本身也可能發生礦化進一步釋放CO2，從而對土壤CO2礦化量產生影響[29]。煤粉塵參與礦化的過程可描述為：當褐煤粉塵進入土壤后，其輸入的有機碳在微生物作用下被分解礦化后向環境中釋放CO2氣體。對這一過程的研究表明，褐煤粉塵能夠被土壤真菌分泌的胞外酶分解，分解后的產物可以被細菌所利用[30-31]。因此，認為褐煤粉塵提高土壤CO2礦化效果由2個部分構成：一是通過激發效應促進了土壤原來有機碳的礦化分解；二是通過土壤微生物的活動分解了煤粉塵中有機組分，進而提高土壤CO2礦化量。

3.2添加褐煤粉塵對土壤活性有機碳檢出量的影響 

結合圖2與圖3（a）得知，土壤ROC含量降低趨勢與土壤CO2礦化累積量增長趨勢并不能直接關聯，土壤ROC的下降并不能表明其參與了土壤有機碳礦化過程。分析認為產生這一現象的原因可能由檢測方式所致，本研究中測定土壤ROC的辦法是經333 mmol/L的KMnO4溶液氧化后，使用紫外分光光度計測定。而有研究表明，KMnO4在煤化工領域中常用于煤炭脫硫作用，經其氧化后可以降低煤中芳香結構的數量并提高煤炭的甲烷產出率[32-33]。上述方法使用的是濃度為0.05~0.25 mol/L的KMnO4溶液，而本試驗中所使用的333 mmol/L的KMnO4溶液濃度明顯要超過這一范圍，過高濃度的KMnO4提取短鏈脂肪族上的碳及其側鏈上的基團，并且由于煤炭中存在的多核芳烴和雜芳族結構亦會遭到破壞而解構[34-35]。因此對受煤粉塵影響土壤的ROC含量測定還需要尋找更合適的檢測方式。

褐煤粉塵在培養初期顯著提高了土壤MBC含量，表明其中所含有機組分導致土壤有機碳發生了激發效應，但這部分促進有機碳礦化分解的過程并不能持續保持。研究表明，添加物料的C/N對土壤微生物活性影響存在明顯區別，外源添加的有機材料C/N不同，對土壤中微生物生物量碳和土壤CO2礦化過程的影響程度也不一致[36-37]。土壤微生物生命活動的最適C/N為25∶1，高于這一數值時土壤微生物缺少生存必需的氮，而過低的C/N則缺乏其生存需要消耗的有機碳，因此高C/N的有機物料在土壤中的表現更加穩定[38]。由表2可知，褐煤粉塵的C/N達到了61.28∶1，遠超微生物生存最適的C/N，所以褐煤粉塵對土壤有機碳礦化的促進效果只能短期內出現卻無法長久保持。 3.3 添加褐煤粉塵對土壤細菌群落結構的調整作用 對土壤細菌進行高通量測序的結果表明，添加褐煤粉塵導致土壤細菌群落結構發生顯著的改變。褐煤粉塵進入土壤后顯著提高土壤細菌群落的豐度、多樣性和變異程度（表3）；縮減了豐度較大的菌群占比，增加豐度較小的菌群占比（圖5），而土壤細菌對褐煤粉塵有機碳的利用在圖5中也能夠顯現，如厚壁菌門在HMA和HMB處理中的顯著增加，源自其中的芽孢桿菌對褐煤具有一定的生物溶解能力[39-40]，其在土壤有機碳的轉化和分解中起到重要作用，也是形成土壤腐殖質的關鍵細菌。

圖6也反映出相似的結論，排名前10的土壤細菌中與土壤有機碳礦化和活性組分呈正相關關系的占到了5種（放線菌、酸桿菌、金針菌、綠霉菌和泉古菌），這5種細菌的增量正好彌補了排名靠前的變形菌和擬桿菌在土壤內的損失。研究表明，變形菌是土壤細菌中豐度最高的一個細菌門類，其在富含有機碳的土壤中相對豐度表現為有所降低[41]，但這一降低并沒有壓制變形菌的活性。而土壤中的有機碳能更顯著地促進其他菌群的擴增，例如有機碳能夠促進放線菌門中紅球菌和酸桿菌門中節桿菌的增加[42-43]。因此可以認為，土壤細菌群落在褐煤粉塵的影響下表現出有跡可循的變化，這些變化過程也證實褐煤粉塵中有機碳對土壤細菌群落活性存在著一定的促進效果。

4.結論

（1）褐煤粉塵可以促進土壤有機碳的礦化分解過程，并且在土壤微生物影響下分解部分自身所含的有機碳組分；其向土壤中輸入大量的芳香族化合物的同時提高土壤ROC、MBC 2種活性有機碳的含量，但上述效果會隨著時間延長而逐漸降低。

（2）褐煤粉塵進入土壤后能夠改變土壤細菌群落的豐度和多樣性，其一方面整體擴大了土壤細菌群落，另一方面提高土壤中占有優勢或具備分解褐煤功能菌群的比例。

（3）褐煤粉塵輸入的有機碳組分能夠參與到土壤有機碳庫的周轉活動中，但其過高的C/N超過土壤微生物的最適范圍，因此上述過程并不能持續維持。

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引用本文: 王浩，王偉，薄慧娟，等.褐煤粉塵對礦區復墾土壤有機碳礦化及細菌群落的影響[J].環境工程技術學報，2024，14（5）：1436-1443 doi: 10.12153/j.issn.1674-991X.20240210 文章來源：環境工程技術學報